Elektrophorese, Analyse von Sequenzpolymorphismen, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung

Elektrophorese

Elektrophorese ist die Wanderung von geladenen Teilchen im elektrischen Feld. Bei der Gelelektrophorese dient ein Gel (meist aus Agarose oder Polyacrylamid) als Trägermedium zur Auftrennung der Teilchen. Neben anderen Faktoren spielt für die Auftrennung das Verhältnis zwischen dem Teilchenradius und der Porenweite des Gels eine Rolle. Es gilt: Kleinere Moleküle wandern rascher und damit in einem gegebenen Zeitraum weiter durch das Gel als größere.

Mithilfe der Agarosegelelektrophorese werden DNA-Fragmente, Plasmid-DNA und auch RNA-Moleküle aufgetrennt. In der Polyacrylamidgelelektrophorese werden kleinere DNA-Fragmente und auch Proteine aufgetrennt.

Analyse von Sequenzpolymorphismen

Der genetische Fingerabdruck wird auch als DNA-Fingerprint oder DNA-Profiling bezeichnet und ist das in hohem Maß individuelle DNA-Profil eines Menschen. Basis für die Herstellung eines genetischen Fingerabdrucks sind abweichende Nucleotidsequenzen (Sequenzpolymorphismen), die über das Genom verteilt sind und in mindestens 2 Varianten vorkommen.

Beim Restriktionsfragmentlängen-Polymorphismus (RFLP) sind sehr spezifische Erkennungssequenzen von Restriktionsendonucleasen von den Sequenzunterschieden betroffen, sodass das Enzym die DNA an dieser Stelle nicht mehr spalten kann. Folge sind Größenabweichungen der Restriktionsfragmente, die durch Spaltung der genomischen DNA mit einem bestimmten Restriktionsenzym entstehen. Für die RFLP-Analyse wird allerdings verhältnismäßig viel Probenmaterial (sprich DNA) benötigt. Zudem sind bei RFLPs nur 2 Varianten möglich – das Enzym kann die DNA entweder spalten oder nicht.

Die Untersuchung von einfachen Sequenzlängenpolymorphismen aus Folgen von sich tandemartig wiederholenden Nucleotidsequenzen, wie sie bei VNTRs (variable number of tandem repeats, Minisatelliten) und STRs (short tandem repeats, Mikrosatelliten) vorkommen, nutzt im Vergleich zur RFLP-Analyse die Polymerasekettenreaktion (PCR) und kommt daher mit einer sehr geringen Menge an Probenmaterial aus. Zudem sind diese DNA-Marker hoch polymorph. Sie kommen in zahlreichen Varianten vor und sind damit sehr informativ. Bereits die Analyse von 16 Loci reicht aus, um eine DNA-Probe mit einer sehr geringen Fehlerquote einem Individuum zuordnen zu können.

Mithilfe des genetischen Fingerabdrucks lassen sich in der Forensik am Tatort gewonnene DNA-Spuren sehr spezifisch Personen, deren DNA-Profil bereits erstellt wurde, zuweisen. Auch Vaterschaftsnachweise und Verwandtschaftsanalysen sind mit dieser Methode möglich.

Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)

Bei der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung lassen sich bestimmte Nucleinsäureabschnitte in Gewebeschnitten, in Zellkernen einzelner Zellen oder in isolierten, vollständigen Metaphasechromosomen durch Bindung einer Nucleinsäuresonde spezifisch nachweisen. Die Sonde ist mit einem Fluoreszenzfarbstoff (Fluorochrom) markiert und kann durch Anregung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge mit einen Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden.

Mit der FISH lassen sich bestimmte DNA-Abschnitte auf den Chromosomen lokalisieren. Durch den Einsatz von verschiedenen Sonden, die mit unterschiedlichen Fluorochromen markiert sind, können mehrere Abschnitte gleichzeitig untersucht werden. Eingesetzt wird die Methode z.B. für den Nachweis von Virusinfektionen oder aber von Translokationen von bestimmten Genabschnitten auf andere Chromosomen.