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Biochemie

PCR (Polymerasekettenreaktion) und RT-PCR

Steckbrief

Die PCR (Polymerasekettenreaktion, polymerase chain reaction) zählt zu den grundlegenden Methoden der heutigen Gentechnik. Ihre Einsatzgebiete sind breit gefächert und reichen von der reinen Grundlagenforschung über die Diagnostik von Infektionskrankheiten und Krebserkrankungen bis hin zur Forensik.

Mithilfe von geeigneten synthetischen Oligonucleotiden (Primern), Desoxynucleosidtriphosphaten (dNTPs) und einer hitzestabilen DNA-Polymerase im Reaktionsgemisch lassen sich geringste Mengen an DNA sehr spezifisch milliardenfach vermehren und nachweisen. Voraussetzung sind zwei bekannte Nucleotidsequenzen, die das zu vemehrende DNA-Fragment flankieren und die als Primerbindungsstellen verwendet werden können.

Die PCR umfasst 20–40 Zyklen einer Abfolge von drei Reaktionen, die bei unterschiedlichen Temperaturen ablaufen:

  • Denaturierung: 95 °C; Trennen des DNA-Doppelstrangs in Einzelstränge

  • Annealing (Anlagerung): ca. 40–55 °C; Hybridisieren der Primer mit der DNA

  • Elongation: 72 °C; DNA-Synthese durch eine hitzestabile DNA-Polymerase

Bei der RT-PCR ist nicht DNA das Ausgangsmaterial, sondern RNA. Die RNA wird jedoch von der Reversen Transkriptase in cDNA umgeschrieben, die dann als Template in die PCR eingesetzt wird.

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Polymerasekettenreaktion (PCR)

Durch die wiederholte Abfolge einer Sequenz aus drei Reaktionen (Denaturierung, Annealing und Elongation) wird die Nucleotidseqenz, die von den beiden Primern (grün) flankiert wird, milliardenfach vermehrt. Die PCR-Produkte können sequenziert, in einen Vektor ligiert oder auf andere Weise weiterverarbeitet werden.

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    Einführung

    Die PCR ist seit über 20 Jahren aus den Laboren nicht mehr wegzudenken. Routiniert wird sie angewendet bei:

    • Genisolierung und Genklonierung

    • Tumordiagnostik

    • Virusnachweisen

    • Verwandtschaftsanalysen

    • Mutationsnachweisen (z.B. im Rahmen der Präimplantationsdiagnostik), bei der die zu untersuchende DNA-Sequenz mithilfe der PCR amplifiziert und anschließend zur Identifikation der Mutation sequenziert wird

    • Evolutionsforschung

    • Identitätsnachweisen

    Mithilfe der PCR kann eine beliebige doppelsträngige DNA-Sequenz in vitro milliardenfach sehr spezifisch vervielfältigt (amplifiziert) und nachgewiesen werden. Das Grundprinzip der PCR entspricht der semikonservativen, exakten Verdopplung der DNA bei der Replikation.

    Voraussetzung für die Durchführung einer PCR ist, dass die flankierenden Nucleotidsequenzen zu beiden Seiten des zu vervielfältigenden DNA-Abschnitts bekannt sind. An diese flankierenden Sequenzen bindet im Reaktionszyklus jeweils ein zu der Sequenz komplementäres Oligonucleotid (Primer). Diese lagern sich gegenläufig orientiert an die Matrizen-DNA und werden während der DNA-Synthese komplementär zum Matrizenstrang verlängert (s.u.).

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      zuletzt bearbeitet: 31.05.2023
      Fachlicher Beirat: Dr. rer. nat. Roland Netzker, 02.10.2022
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