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Werkzeuge der Gentechnik: Restriktionsendonucleasen, Plasmide, Reverse Transkriptase

  •  IMPP-Relevanz
  • Lesezeit: 8 min
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Steckbrief

Im Zuge der Entwicklung der Gentechnik wurde ein riesiges Repertoire an Methoden etabliert, um DNA zu spalten, zu verknüpfen, zu replizieren, zu manipulieren und RNA revers zu transkribieren. Diese Methoden bedienen sich einiger unentbehrlicher Werkzeuge wie Restriktionsendonucleasen, Plasmide und Reverse Transkriptase. Durch die Anwendung dieser und weiterer Hilfsmittel ist es heute möglich, Nucleotidsequenzen zu analysieren und die genetische Ausstattung von Organismen gezielt zu verändern.

Restriktionsendonucleasen

Restriktionsendonucleasen (Restriktionsenzyme) vom Typ II erkennen in doppelsträngiger DNA sehr spezifisch bestimmte Nucleotidsequenzen und spalten dort den Doppelstrang. In der Gentechnik dienen sie als spezifische molekulare Skalpelle. Die Reaktionsprodukte (Restriktionsfragmente) lassen sich leicht mit anderen, entsprechend vorbereiteten DNA-Molekülen wie Vektoren verknüpfen.

Plasmide

Die in den meisten prokaryontischen Zellen auch natürlicherweise vorkommenden Plasmide wurden für bestimmte experimentelle Anwendungen optimiert. Diese modifizierten Plasmide dienen als Vektoren (Transportvehikel). Sie nehmen relativ leicht beliebige Fremd-DNA-Fragmente auf und werden anschließend in eine Wirtszelle eingeschleust. Dort werden sie z.B. stark repliziert oder die in ihnen enthaltene Fremd-DNA wird exprimiert.

Reverse Transkriptase

Die Reverse Transkriptase ist ein im retroviralen Genom codiertes Enzym. Mit ihren drei Aktivitäten (DNA- und RNA-abhängige DNA-Polymerase und RNase H) wird die Reverse Transkriptase genutzt, um aus einer RNA (meist mRNA) eine komplementäre DNA (cDNA) herzustellen, die sich in einen Vektor ligieren, klonieren und weiter analysieren lässt.

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    Restriktionsendonucleasen

    Die Aufnahme exogener DNA ist eine unter Prokaryoten verbreitete Eigenschaft. Das Eindringen fremder DNA kann jedoch auch schwerwiegende Folgen haben, wie es beispielsweise bei einer Phageninfektion der Fall ist. Viele prokaryotische Wirtszellen können jedoch z.B. anhand der Methylierung bestimmter Basen zwischen eigener und fremder DNA unterscheiden und Fremd-DNA (wie die DNA von Phagen) mithilfe von spezifischen DNasen, den Restriktionsendonucleasen (Restriktionsenzyme), abbauen (Restriktion). Es gibt 3 verschiedene Typen von Restriktionsendonucleasen mit zahlreichen Subtypen, wobei für die Gentechnik nur die Typ-II-Restriktionsendonucleasen von Bedeutung sind.

    Die Restriktionsendonucleasen erkennen in sehr spezifisch bestimmte Nucleotidsequenzen und spalten den Doppelstrang. Bei Typ-II-Restriktionsendonucleasen befinden sich die Spaltstellen innerhalb der 4–8 bp langen Erkennungssequenzen.

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    Synthese von DNA aus RNA durch die Reverse Transkriptase

    Die Reverse Transkriptase synthetisiert einen zum viralen RNA-Strang komplementären DNA-Strang (RNA-abhängige DNA-Synthese). Es entsteht ein RNA-DNA-Hybrid. Die RNase-Aktivität der Reversen Transkriptase (RNase H) baut den RNA-Strang ab. Das virale Genom liegt nun als DNA-Einzelstrang vor, den die Reverse Transkriptase als Matrize für die DNA-abhängige DNA-Synthese nutzt, sodass schließlich ein DNA-Doppelstrang vorliegt.

    (Quelle: Königshoff, Brandenburger, Kurzlehrbuch Biochemie, Thieme, 2018)
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      zuletzt bearbeitet: 17.11.2022
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