Proteine: Trennung, Nachweis und Strukturaufklärung

Bevor Struktur und Funktion eines einzelnen Proteins untersucht werden können, muss es von anderen zellulären Bestandteilen und anderen Proteinen getrennt werden. Dies geschieht unter Ausnutzung seiner typischen Eigenschaften wie Größe, Löslichkeit, Ladung und Bindungskapazität. In einem ersten Schritt werden die Proteine u.a. mithilfe einer differenziellen Zentrifugation von anderen Zellbestandteilen getrennt.

Um einzelne Proteine voneinander zu isolieren, wird das Proteingemisch über verschiedene Verfahren weiter aufgetrennt. Eine Möglichkeit der Separation sind chromatografische Verfahren (z.B. Gelfiltrations-, Ionenaustausch-, Affinitäts- und die Hochleistungsflüssigkeitschromatografie, die auf einer Verteilung der zu trennenden Bestandteile eines Gemisches zwischen einer stationären und einer mobilen Phase beruhen. Außerdem können Proteine in der Gelelektrophorese (native Gelelektrophorese, SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, isoelektrische Fokussierung, zweidimensionale Gelelektrophorese), Elektrophorese auf Celluloseacetatfolie wie auch der Kapillarelektrophorese getrennt werden, bei denen sie in einem elektrischen Feld wandern und nach ihrer Masse oder ihrer Nettoladung separiert werden. Eine Möglichkeit der Trennung von Proteinen nach ihrem Sedimentationskoeffizienten ist die Dichtegradientenzentrifugation. Die unterschiedlichen Trennverfahren können, je nach Fragestellung, analytisch oder auch präparativ durchgeführt werden.

Die getrennten Proteine können in immunologischen Verfahren mithilfe spezifischer Antikörper nachgewiesen und quantitativ bestimmt werden. Häufig eingesetzte Methoden sind der Western-Blot, bei dem gelelektrophoretisch aufgetrennte Proteine auf eine Membran übertragen (geblottet) und dort detektiert werden. Beim ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) werden in einer Probe vorhandene Antigene oder auch Antikörper auf einem Träger immobilisiert und mithilfe von spezifischen Antikörpern nachgewiesen und auch quantifiziert. Für die Untersuchung der Funktion eines Proteins in einem physiologisch relevanten Kontext werden Proteine in immunhistochemischen Verfahren mithilfe von spezifischen Antikörpern in Zellen oder Geweben lokalisiert. Die Quantifizierung aufgereinigter Proteine erfolgt mithilfe von chemischen und optischen Verfahren.

Die Strukturaufklärung eines Proteins liefert wertvolle Hinweise auf seine Funktion. Ein erster Schritt ist die Ermittlung der Aminosäurezusammensetzung eines Proteins, indem man es durch Hydrolyse in seine Bausteine zerlegt, diese mit chromatografischen Verfahren auftrennt und quantifiziert. Die Proteinsequenzierung dient dagegen der Ermittlung der Primärstruktur eines Proteins. Beim Edman-Abbau werden die Aminosäurebausteine nacheinander von einem Ende des Proteins abgespalten und mit Chromatographieverfahren identifiziert. Über seine Aminosäuresequenz lässt sich das Protein möglicherweise in Sequenzdatenbanken auffinden und identifizieren. Auch kann man u.U. Ähnlichkeiten mit weiteren Proteinen aufdecken. Massenspektrometrische Verfahren können über die Ionisierung von Proteinen, die Ermittlung ihrer genauen Masse und die Suche in entsprechenden Datenbanken ebenfalls Hinweise auf die Identität eines Proteins liefern. Auch sie werden zur Proteinsequenzierung eingesetzt. Aus reinen Proteinen lassen sich Kristalle herstellen. Röntgenstrukturanalysen dieser Kristalle liefern wiederum Informationen über die dreidimensionale Struktur des Proteins.